高分辨率熔解技術(shù)(high resolution melting，HRM)僅僅通過(guò)PCR之后的熔解曲線分析，就能檢測(cè)PCR片段的微小序列差異，從而應(yīng)甩于突變掃描、序 列配對(duì)和基因分型等多個(gè)方面(Liu et al一2010)。雙鏈D\A的熔解分析可追溯到20世紀(jì)60年代，當(dāng)時(shí)是通過(guò)紫外吸收來(lái)監(jiān)測(cè)的。分析需要幾微克的DNA，而樣品以(0.1～1.0)℃／min的速率緩慢加熱，常常要花上幾個(gè)小時(shí)才能完成：后來(lái)，LightCycler定量PCR儀的出現(xiàn)，讓熒光熔解分析變得流行：樣品量因毛細(xì)管而縮減至納克級(jí)，且熔解速率更快，達(dá)(0.1～1.0)℃/S，熔解時(shí)間縮短至幾分鐘，當(dāng)時(shí)使用的染料是SYBR Green I。然而，這種熔解分析只能區(qū)分在片段大小和GC含量上差別較顯著的DNA序列，如檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在引物二聚體及其他非特異性的擴(kuò)增。如果要區(qū)分SNP，分辨率還不夠。SYBR Green I屬于非飽和性染料，由于它對(duì)PCR的抑制作用，在實(shí)驗(yàn)中的使用濃度很低，遠(yuǎn)未將DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝飽和。這樣，DNA雙鏈高溫變性時(shí)，單鏈部分的熒光染料分子發(fā)生重排，熒光染料分子重新結(jié)合到雙鏈DNA的空置位點(diǎn)，造成熒光信號(hào)沒(méi)有變化，因此出現(xiàn)假陰性，特異性下降。而飽和染料即便在飽和濃度（熒光最大）下，也不會(huì)抑制PCR，故高濃度的染料飽和了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝，在DNA觶鏈過(guò)程中就不會(huì)發(fā)生重排，這樣熔解曲線才有了更高的分辨率。目前市場(chǎng)上的飽和染料主要有LC Green、LC G，een Plus等幾種。
擴(kuò)增子的熔解曲線完全取決于DNA堿基序列。序列中如有一個(gè)堿基發(fā)生了突變，就會(huì)改變DNA鏈的解鏈溫度，但是這個(gè)差異極小，只有零點(diǎn)幾攝氏度，如果儀器的分辨率不高，是根本無(wú)法檢測(cè)的。那么什么樣的分辨率才是高分辨率呢？根據(jù)儀器現(xiàn)有的功能測(cè)試，在熔解操作時(shí)每攝氏度至少要獲得10個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，這是對(duì)儀器的最低要求。此外，溫度均一性也同樣重要。如果兩孔之間溫度相差0.1℃，就很可能導(dǎo)致最終的熔解溫度相差0.1℃，這樣就無(wú)法保證HRM分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。大多數(shù)常規(guī)定量PCR儀的孔間溫度差為0.3～0.5℃，這也決定了它們無(wú)法勝任HRM。
目前市場(chǎng)上有多個(gè)廠家提供HRM分析的儀器，包括Idaho Technology、Corbett (QIAGEN)、Roche等，有些是專供HRM的儀器，有些則是附帶HRM功能的定量PCR儀。在擁有飽和染料和高分辨率儀器之后，HRM分析過(guò)程其實(shí)很簡(jiǎn)單，就是對(duì)PCR的擴(kuò)增子進(jìn)行加熱，溫度從50℃逐漸上升到95℃。在此過(guò)程中，擴(kuò)增子逐漸解鏈，在到達(dá)熔解溫庋(L)時(shí)，DNA鏈完全分開。在HRM分析的初期，熒光強(qiáng)度很高，隨著溫度升高，雙鏈DNA逐漸減少，熒光強(qiáng)度也就隨之下降了。HRM儀器通過(guò)照相機(jī)記錄下熒光變化的整個(gè)過(guò)程。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，就生成了熔解曲線。
綜上所述，HRM技術(shù)應(yīng)用廣泛，操作簡(jiǎn)單又經(jīng)濟(jì)，結(jié)果精確且可靠，適合任何實(shí)驗(yàn)室使用。市場(chǎng)上有一些專供HRM分析的儀器，不過(guò)，那些帶有HRM功能的定量PCR儀則更實(shí)用。QIAGEN的Rotor-Gene Q(Corbett Rotor-Gene 6000)就是全球第一臺(tái)將實(shí)時(shí)擴(kuò)增與HRM分析技術(shù)相結(jié)合的實(shí)時(shí)熒光定量分析裝置。Rotor-Gene Q的溫度均一性為0.01℃，解決了溫度均一性，精確性和分辨率的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了定量擴(kuò)增與HRM的合二為一。
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